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細(xì)胞百科

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4度?-20度?-80度?外泌體到底應(yīng)該怎樣保存?

近年來,隨著干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展,由干細(xì)胞分泌的微小囊泡——外泌體,也逐漸成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn),被應(yīng)用于多種疾病臨床試驗(yàn)研究之中。


盡管越來越多的科研實(shí)驗(yàn)證實(shí)外泌體用于臨床應(yīng)用的有效性,但如何穩(wěn)定保存外泌體、怎樣可以不喪失其功能性顯得尤為重要,甚至成為了評(píng)判一款外泌體產(chǎn)品優(yōu)劣的關(guān)鍵性因素。





外泌體的保存/ EXOSOMES

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外泌體是具有雙層脂膜的囊泡結(jié)構(gòu),其穩(wěn)定性較好,可保護(hù)內(nèi)部生物分子免受體液中各種酶的影響,從而保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌體的完整性和生物活性也可能受到保存介質(zhì)、保存溫度和時(shí)間等因素的影響。


目前,最常用的儲(chǔ)存方法為冷凍保存,但是冷凍保存可能會(huì)導(dǎo)致外泌體形狀與物理性質(zhì)的改變,也可能導(dǎo)致多層囊泡的形成和聚集,反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致外泌體表面分子的生物特性、含量和標(biāo)志物組成發(fā)生變化。 


血清中包含外泌體在內(nèi)的細(xì)胞外囊泡DNA在不同儲(chǔ)存環(huán)境可保持穩(wěn)定, 血漿存放于4°C時(shí)其RNA會(huì)顯著降解, 在–20°C下長(zhǎng)期保存也會(huì)導(dǎo)致血漿中外泌體總RNA降解, 但miRNA卻十分穩(wěn)定 這也提示了外泌體miRNA作為生物標(biāo)志物的潛力。


不過也有研究表明, 血清中的miR-122和miR-145非常不穩(wěn)定, 將血清在4°C短期保存期間即發(fā)生降解, 這可能是由外泌體的異質(zhì)性所導(dǎo)致的。–80°C保存被公認(rèn)是保存各種生物標(biāo)本如精液、尿、牛奶、 血液和支氣管肺泡灌洗液最適宜的保存環(huán)境,雖然這樣保存血漿可能產(chǎn)生含有大量“污染物”的外泌體。4°C保存雖然容易導(dǎo)致外泌體中蛋白和核酸的損失, 但卻能夠避免凍融過程造成的囊泡破壞。 



實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)的外泌體存儲(chǔ)條件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一項(xiàng)研究中,研究者評(píng)估了儲(chǔ)存在4℃,-20℃和-80℃下長(zhǎng)達(dá)28天的外泌體的穩(wěn)定性,并將其與新鮮的外泌體進(jìn)行了比較。


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外泌體在儲(chǔ)存于?80 °C,?20 °C,以及4 °C 下,0、7、15以及30天后,再通過WB檢測(cè)三種外泌體標(biāo)記物TSG101,HSP70和ALIX的水平。結(jié)果顯示,在4℃下放一個(gè)月,外泌體的標(biāo)記蛋白幾乎完全降解,活性全無。


研究者發(fā)現(xiàn),與新鮮分離的外泌體相比,不同的存儲(chǔ)溫度和存儲(chǔ)時(shí)間會(huì)影響外泌體的穩(wěn)定性、大小分布和顆粒數(shù)量(Fig.1),并影響了外泌體的細(xì)胞吸收和生物分布(Fig.2)。對(duì)于功能性研究,根據(jù)研究設(shè)計(jì)建議對(duì)新鮮分離的外泌體進(jìn)行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是對(duì)于長(zhǎng)期保存用于治療應(yīng)用的外泌體,-80℃存儲(chǔ)條件將是更可取的。 


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不同存儲(chǔ)條件對(duì)外泌體大小和結(jié)構(gòu)的影響


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不同存儲(chǔ)條件對(duì)外泌體蛋白成分的影響


實(shí)驗(yàn)結(jié)果:在-20℃和-70℃下保存的外泌體比較完整無損,而4℃和室溫下CD63已基本沒有表達(dá),室溫保存條件下HSP70的表達(dá)量也有所降低。相較于4℃、-70℃和新鮮樣本,室溫存放的外泌體蛋白和RNA濃度的降低程度較明顯。研究說明,-20℃或更低溫度是比較可取的外泌體長(zhǎng)期存儲(chǔ)條件。 



外泌體雖然建議保存于?80 °C環(huán)境下, 但在處理或運(yùn)輸過程中有時(shí)很難維持這種低溫條件。

研究發(fā)現(xiàn)一種凍干法可以保存外泌體,在冷凍過程中使用海藻糖作為保護(hù)劑,海藻糖可以提供生物保護(hù)作用,如穩(wěn)定蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和脂質(zhì)體;減少冷凍過程中冰的形成;防止蛋白質(zhì)以及外泌體的聚集;減少分離和保存過程中細(xì)胞外囊泡的損失等。這是目前外泌體應(yīng)用在護(hù)膚品中最常用的形式。


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參考文獻(xiàn):Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes   Protein Cell 2019, 10(4):295–299  https://doi.org/10.1007/s13238-018-0529-4